분 석 장 비

■ 가스크로마토그래피(Gas Chromatography)
(HP- 5890/ 6890, 베리안 3400/3600/3800)

I. 일반사항

1. 목 적
유기화합물에 대한 정성 및 정량분석

2. 개 요
적당한 방법으로 전처리한 시료를 운반가스(Carrier Gas)에 의하여 크로마토 관내에 전개시켜 분리되는 각 성분의 크로마토그램을 이용하여 목적성분을 분석한다.

3. 사양 및 성능
검출기에 의한 GC의 사양 및 성능

* Sensitivity : Response per amount of sample
* MDL(minimum detectable level)
: peak높이가 noise높이보다 2내지 3배가 되는 시료양으로 정의
* Selectivity : Detector가 감지할수 있는 성분의 범위로 정의

selective detector : element selective,
structure/functional group selective,
other properties selective
specific detector : FPD, NPD, GC/MSD, GC/IRD
Dynamic range : response(peak area per weight of sample)

II. 표준작동절차

분석에 필요한 Gas를 OPEN 시킨다.(봄베압력 : Air 40 PSI, H2 20 PSI, He 40 PSI)
↓
GC POWER를 ON시킨다.
↓
Column을 연결한다.
↓
검출기에 필요한 Gas 의 유량을 맞춘다. FID ( H2:30㎖/min, Air:300㎖/min, He:30㎖/min )
FPD ( H2:80㎖/min, Air:100㎖/min, He:20㎖/min ) ECD ( N2:30-60㎖/min, Anode purge )
↓
Aux Gas + Column 유량(30㎖/min)을 맞춘다.
↓
Splite Ratio(50 : 1)를 맞춘다.
↓
Injection Port, Detector 및 Oven온도를 맞춘다.
↓
FID, FPD는 불꽃을 점화한다.ECD는 Gas만 OPEN한다.
↓
Conditioning 한다.
↓
GC가 안정화되면 원하는 분석조건으로 맞추어 분석한다.

표1. GC 조작시 순서도

1. 준비사항

1) 사용가스

(1) ECD : 초고순도 N₂
(2) FID, FPD : 초고순도 N₂, 초고순도 H₂, Air

2. 기기의 운영순서

1) GC에 필요한 Gas Bomb(Cylinder)을 모두 OPEN시켜준 후 메인 벨브를 열어 준다.
2) 기기 본체 오른쪽 하단의 전원 Switch를 켠다.
3) Computer의 전원을 켠다.
4) 본체의 Self Test가 완료되면 Computer 바탕화면에서 FID인 경우 “Instrument 1”, FPD인 경우 “Instrument 2” ECD인 경우엔 “Instrument 3”을 Click한다.
5) Computer화면에 Method & Run Control이 상단에 있는 화면이 나오면 "Method" 에서 “Road Method”를 선택하여 원하는 분석방법을 선택한다.
6) FID는 Air, H2, He 가스가 든 Bomb 세 개를 OPEN하기 위하여 Main Valve를 돌려 모두 열고 PAK(Pressure Adjusting Knob)를 시계방향으로 돌려서 2차 Gauge의 압력을 Air는 40PSI, H2는 20PSI, He는 40PSI로 맞춘다.
7) Detector Gas Control 및 Inlet Carrier Gas Control이 모두 닫혀있는지 확인하여 Gas의 흐름이 없도록 한다.
8) Capillary Column을 연결한다.
Column은 Oven내부에 연결하되, Column의 앞과 뒤 관계없이 Inlet(Injection Port) 그리고 한쪽은 Detector에 연결한다.
9) 검출기에 필요한 Gas의 유량을 맞춘다.
FID에는 불꽃을 형성시켜주기 위하여 Air(300～400㎖/min) 및 H2(30～40㎖/min)가 필요하며 Column에서 부족한 Carrier Gas(이동상)를 보충해 주는 (Auxilary Gas(30～40㎖/min))를 맞추어야 한다.
FPD에는 불꽃을 형성시켜주기 위하여 Air(100～120㎖/min) 및 H2(80～100㎖/min)가 필요하며 Column에서 부족한 Carrier Gas(이동상)를 보충해 주는 (Auxilary Gas,(20～40㎖/min))를 맞추어야 한다.
ECD는 N2를30～60㎖/min으로 맞춘다.
10) 본체 안쪽 하단에 있는 Total Flow를 왼쪽으로 2.5바퀴 돌린다.
11) 검출기의 온도가 150℃ 이상이 되면 본체 왼쪽상단에 있는 Air를 왼쪽방향으로 끝까지 열어주고 Hydrogen을 왼쪽으로 돌리며 Ignitor를 눌러 점화를 시키고 Aux도 왼쪽으로 끝까지 돌려준다.(FID, FPD인 경우)
ECD는 본체 왼쪽 상단에 Anode Purge와 Aux Gas를 왼쪽으로 끝까지 열어준다.
12) 왼쪽 상단에서 붉은색의 “Not Ready"가 연두색의 "Ready"로 변환하면 원하는 시료를 분석한다.
13) 분석을 완료할 경우에는 우선 Gas 봄베를 잠근 후 본체의 벨브도 모두 잠그고 온도가 내려가면 Switch를 꺼서 종료한다. Computer는 화면에 “File"에서 "Exit"로하여 종료한다.

◎ 분석의 예

* 시험명 : 물 시료중 Trichloroethylene 분석

물 시료를 50㎖의 용량플라스크에 눈금까지 취함
↓
Hexane 5㎖를 첨가
↓
2～3분간 상?하로 흔들어 추출
↓
물과 Hexane* 층을 분리
↓
무수황산나트륨**으로 탈수
↓
Hexane으로 5㎖정용
↓
GC(ECD)

* Hexane300:(min 96%, 시약급, Junsei, JAPAN,잔류농약시험용)
** 무수황산나트륨(Na2SO4, Anhydrous 99%, 시약급 Oriental Chemical, Korea)
참 고 : - 맑은 물일 경우는 무수황산나트륨을 사용하지 않고 물층과 분리된 Hexane
층을 이용하여 직접 분석하여도 됨.
- 부유물질 제거용으로는 Target Syringe Fillter
(13㎜ Teflon Syringe Filter, 0.45㎛)

3. 분석조건

1) 시험시의 분석조건은 다음과 같다.

(1) Column : HP-1(Cross-Linked Methyl Silicone)
25㎜×0.32㎜×0.52㎛
(2) Column Flow : N2, 60㎖/min
(3) Oven Program : 40℃(2min) to 200℃(10min) at 10℃/min
(4) Injection : 1㎕, Split 50:1
(5) Detector : ECD

4. 설비점검

1) 운반가스중의 불순물제거
운반가스중의 수분이나 저분자량 탄화수소류, 산소등의 미량불순물은 기기에 주입하기 전에 제거해야 한다.
일반적인 제거 방법은 가스봄베와 가스크로마토그라프 사이에 Trap을 설치하는 것이다

(1) Moisture Trap
운반가스중의 수분은 칼럼을 손상시킬수 있으므로 모든 운반가스, 검출기 종류와 상관 없이 검출기 보조가스들(make up, H2, Air)에 설치한다.
(2) Oxygen Trap
운반가스중에 함유된 산소는 분리관의 액상과 반응을 일으켜 분리관을 손상시키고, ECD를 사용 할 경우 매우 큰 신호를 나타내며 분석을 어렵게 하며 검출기의 필라멘트 수명을 단축시키게 된다.

2) 운반가스의 누설시험
운반가스의 누설여부는 수시로 확인한다. 특히 분리관을 교환했을 때나 운반가스의 소모가 심할 때는 반드시 점검하여야 한다.
가스누설검사에 사용되는 방법은 여러 가지가 있으나 가장 흔히 사용되는 방법은 비눗물을 이용하는 것이다. 이때, 비눗물이 관 안에 스며들게 되면 수분이나 기타 불순물에 의해 오염이 되므로 주의하여야 한다.
우리가 가장 흔히 가스누설을 경험하게 되는 것은 관의 연결 부분이다. 분리관을 교환한다거나 운반가스를 교환할때 tube fitting이 맞지 않으면 가스누설 위험이 있다. 또한 운반가스에 연결된 fitting은 오래되면 느슨해지는 경향이 있다. 따라서 분리관 교환 후나 운반가스 교체시 그리고 운반가스 연결관은 수시로 누설여부를 확인하여야 한다.

3) 주입구의 가스누출검사

(1) 검출기를 끄고 모든 온도를 상온으로 낮춘다.
(2) 컬럼을 제거하고 주입구 밀부분을 막는다.
(3) Septum 퍼지 벤트를 잠근다.
(4) 컬럼헤드 압력이 20 psi가 되도록 조정한다.
(5) Total Flow를 잠그고 주입구 유량을 차단한다.
(6) 10분정도 기다려 컬럼헤드 압력이 19psi 이하로 떨어지지 않으면 누출이 없다고 본다.

4) 라이너
Split/Splitless capillary inlet system을 사용할때 사용할때 좋은 크로마토그램을 얻기 위해서는 분석하여야 할 시료에 맞는 라이너를 선택해야 한다. 현재 다양한 형태의 라이너가 공급되고 있으며 이러한 라이너들은 다음과 같은 역활을 한다.

(1) 주입된 시료로 열을 효율적으로 전달시켜 시료의 휘발을 용이하게 한다.
(2) 가화된 시료성분을 잘 혼합시켜 준다.
(3) 비휘발성 물질들이 컬럼으로 주입되는 것을 막는다.

5) Column Bleed
Column의 고정상인 siloxane polymer가 고리화합물을 형성하여 작은 조각으로 쪼개짐으로써 나타나는 현상으로 모든 column에서 어느 정도의 bleed는 일어난다. Bleed정도는 column의 두께가 두꺼울수록, 내경이 클수록, 길이가 길수록 커진다. 또한, oven의 온도가 column의 최대온도에 근접할수록 커진다.
특히, carrier gas 중에 산소가 포함되었거나 시료 중에 포함된 오염물질이 있으면 bleed 현상이 촉진될 수 있으므로 이러한 경우에는 원인을 제거해 주는 것이 좋다.

(1) Column bleed의 원인

① Carrier Gas
- 최대감도로 분석하려면 1ppb 이하의 산소가 포함된 Carrier gas 사용.
- Research grade(99.9999%)의 carrier gas 사용
- Trap을 사용.
② Carrier Gas Regulator and Tubing
- Metal 성분으로 된 Regulator 사용(고분자 화합물의 경우 산소나 그 외의 오염물질이 스며들수 있음.)
- Copper 나 stainless steel tubing 사용.
③ System Leak
- 오염된 부분이 없다면 system leak test 실시.
④ Leak가 없는 경우
오븐의 온도를 column의 최대한계 온도로 setting한 후 baseline을 그린다.
- 만약, baseline이 빠른 속도로 올라가며 안정화되지 않을 경우 Column 자체가 문제가 있으므로 복구가 불가능.
- 만약, baseline이 빠른 속도로 올라가다가 (peak처럼) 계속 안정화될 경우 Oven 온도를 올리기 전에 충분히 purging 하지 않은 경우이므로 baseline이 안정될때까지 conditioning
- 만약, baseline이 빠른 속도로 올라가다가 피크가 나타나는 것처럼 서서히 최대로 올라간 후, 안정 될 때는 비휘발성 물질에 의해 column이 막혔을 수 있으므로 1/2meter 정도 cutting

6) 주입구점검 및 세척방법

(1) 주입구의 온도를 낮추고 Septum과 라이너를 제거한 후 후레쉬로 주입구 내부를 비추어 보아 오염된 상태이면 세척해야 한다.
(2) 면봉에 적당한 용매를 묻혀 세척하거나 오염물질이 입자인 경우에는 내부벽에 흠이 생기지 않도록 주의하면서 부러쉬를 사용하여도 된다.
(3) 압축공기 혹은 질소로 용매를 말린다.(가능하면 보호안경 착용)

Ⅲ. Trouble Shooting

1. 일반적 주의사항

1) 사용 목적에 적합한 기기를 선택하였는가?
2) GC Column은 정상적으로 부착되어있는가?
3) Gas의 압력은 충분한가?
4) Septa의 상태는 양호한가?
5) Program상에서의 온도 설정은 적합한가?
6) 시료의 전처리는 GC분석에 적합하도록 수행되었는가?

2. 증상에 따른 조치

1) FID, FPD의 경우 점화가 되지 않을 경우
2) 수소와 공기의 Gas 압력을 확인한다.
(압력이 낮으면 각각 순도에 맞는 Gas로 교체한다.)
3) 점화 Ignitor가 작동하지 않을 때에는 검출기 출구에 라이터를 이용하여 점화한다.
4) Detector의 온도가 적정한 온도까지 올라왔는지 확인한다.
(최소 Detector의 온도를 200℃까지 올린 후 점화시킨다.)

3. Signal의 노이즈가 심할 경우

1) Gas의 순도 여부를 확인한다.
(초고순도 질소, 초고순도 수소, 압축공기이어야 한다.)
2) 기기 우측에 붙어있는 Trap의 활성을 확인한다.
(Trap이 변색되었을 경우에는 즉시 구매하여 교체한다.)
3) Injection Port의 오염 여부를 확인한다.
(Injection Port의 liner를 교체한다.)
4) Detector Port의 오염여부를 확인한다.
(FID의 경우에는 분해하여 세척하고, FPD나 ECD의 경우에는 서비스 요청하여 조치한다.)
5) 이전에 주입한 시료가 모두 Column을 통과했는지 확인한다.
(Column의 온도를 올리고 운반기체의 압력을 올려 이전에 주입한 시료의 잔존물들을 모두 Column에서 배출시킨다.)

4. Column의 안정화

1) FID, FPD 점화되면 Signal이 점차적으로 증가하여 수백 또는 수만 까지 증가 : Column내에 불순물이 유출되고, 기기상태가 안정화되지 않음
(Column의 한계온도(Max.Temp.)보다 20℃아래까지 올려서 Signal이 감소 하여 고정될 때까지 기다린다.(FID : 1～2시간, FPD, ECD : 10시간 이상), Signal이 안정된 후 Oven 온도를 40～50℃까지 내려서 Signal이 FID, ECD :10～60, FPD : 240～260 사이에 들어야 하며 그렇지 않을 경우, 계속 안정화시킨다. 이때도 안정화가 되지 않으면 Column연결 및 오염, Septum, Detector오염 등을 고려하여야 한다.)

5. 주의사항

1) ECD의 Signal이 100이상일 때 Detector가 오염된 경우 Glass 재질의 Column을 Injector 및 Detector 부분에 연결한 뒤 Column Flow가 30～50㎖/min 되도록 유량을 맞춘 후 ECD 온도를 280℃로 한 뒤 밤새 Thermal Conditioning 시킨다.
2) FID, FPD의 경우 검출기의 온도가 150℃가 되지 않았을 경우 점화해서는 안된다. 점화 시 수소와 산소가 연소하여 물이 생성되므로 150℃ 이상이 되어야 물이 용출되지 않는다. 검출기의 온도가 150℃ 이상 되었을 때 점화를 시키면 순간에 출구에서 약간 폭발하는 소기라 들리거나, Monitor상의 Signal이 순간적으로 올라가게 된다. 이때 Signal의 증가만으로 점화의 유무를 확실히 확인할 수 없으므로 유지나 Metal 등 표면이 차갑고 매끈한 물체를 FID 및 FPD 출구에 대면 수증기를 육안으로 확인할 수 있어 점화 상태를 알 수 있다.
3) 시료를 주입하여도 Peak가 전혀 나오지 않을 때는 Column내로 유속이 흐르지 않는 경우와 Injecter 내부의 Septum구멍이 넓어져 생길 수 있는데, 전자의 경우는 유속이 정상적으로 흐르고 있는가를 확인하고 후자의 경우는 Setum을 교환하여 준다.

Ⅳ. 분석상 특이사항

1. 미지의 시료를 분석할 때에는 먼저 GC-Clumn을 확인한 후 적당한 용매로 추출하여 소량을 Injection 한다.
Column에 맞지 않는 용매를 사용하면 Column의 수명이 짧아지고 원하는 Chromatogram을 얻지 못한다.

2. B.P가 비슷한 물질들이 혼합된 시료를 분석할 때에는 온도 상승률을 느리게 설정하여 Chromatogram이 잘 분리될 수 있도록 한다.

3. Sample Injection한 후 Program Start를 바로 누른다
이때 주입시간을 일정한 속도로 주입하여야 한다.

4. 시료주입기술(Sample Injection Technique)
시료주입기술에 따라 분석결과에 대한 재현성 및 정확성에 많은 차이가 있을 수있다. 따라서 여러가지 시료주입방법을 습득하여 분석하고자 하는 시료에 적절한 주입방법을 선택하여 시료를 주입하는 것이 바람직하다.

1) Filled Needle Technique
가장 일반적으로 사용되는 주입기술로서 시료를 주사기 바늘과 주사기 배럴에 채워서(보통 시료량은 1-2 ㎕정도) 주입하는 방법이다. ALS(Auto Liquid Sampler)사용 할 때에는 항상 filled needle technique을 사용하게 된다.
2) Cold Needle Technique
시료는 주사기 배럴에만 채우고 실린지 바늘에는 공기를 채워 시료를 주입하는 기술이다. 재현성이 ①에 비해 양호하다.
3) Air Plug Technique
이 방법은 Cold Needle Technique과 유사한 방법이나 시료를 실린지 배럴에 채우기 전에 3㎕ 정도 공기를 채우고 시료주입 시 바늘을 주입구에 삽입한 후 2-4초 가열한 뒤 가능한 빨리 시료를 주입한다.
4) Solvent Flush Technique
이 방법은 주사기 배럴에 순수한 용매 소량을 먼저 채운 후 1㎕공기, 1㎕시료, 1㎕공기 순으로 실린지를 채운다. 이 방법은 재현성이 매우 좋지만 이때 사용되는 용매가 고순도 이어야 하고 시료 분석 시 실린지 배럴에 채워진 용매로 인해 용매피크가 매우 크게 나타날 수 있다는 것도 주의해야 한다. 또한 주입구나 컬럼으로 시료의 양이 너무 많이 주입되지 않도록 용매와 시료의 양을 적게 사용해야 한다.
5) Sandwich Technique
Solvent flush technique과 유사한 방법이나 마지막으로 채운 1㎕의 공기 다음에 또 다시 순수용매를 소량 채운다. 이때 주입구나 컬럼에 과량의 시료가 주입되지 않도록 하는 것이 좋다. 액체 시료인 경우 시료 주입량이 3㎕이상을 넘지 않도록 한다. 이 방법은 on column이나 direct injection에 적합하다.
6) 주사기 세척(Syringe clearing)
시료 분석후 주사기를 깨끗하게 세척하지 않은 경우 다음과 같은 트러블이 발생될 수 있다.
첫째, ghost peak가 나타날 수 있다.
둘째, 시료의 정량분석에 대한 재현성이 크게 떨어진다.
세째, Septum의 수명이 단축되며 가루가 라이너내로 들어갈 수 있다.
따라서 위의 트러블을 제거하기 위해서는 주사기를 올바른 방법으로 세척해주는 것이 바람직하며 그 순서는 다음과 같다.

(1) 주사기의 배럴과 바늘에 채워져 있는 시료를 제거한다.
(2) 비극성용매(ex. hexane)를 주사기에 채우고 잔존해 있는 시료가 녹을 수 있도록 기다린 후 이 용매를 버린다.
(3) 극성용매(ex. acetone)를 주사기에 채우고 3-4분 정도 기다린 후 용매를 버린다.
(4) 위의 과정을 3-4회 반복한다.
(5) 플런저를 주사기에서 빼내어 깨끗한 티슈로 부드럽게 닦아낸다.
(6) 플러저가 없는 상태에서 주사기의 바늘을 가열된 주입구에 꽂아 놓는다.
이동상 기체가 주사기와 배럴을 건조시킨다.

■ 고성능액체크로마토그라피(HPLC)

I. 일반사항

1. 목적
액상샘플중의 유기물 정성 및 정량분석

2. 개요
고성능액체크로마토그라프(HPLC)는 액상성분을 분석하기 위한 가장 일반적이며 재현성이 좋은 분석기이다. 분리관이라든가 검출기, 이동상등의 비율등 분석조작 조건을 적당히만 선택하면 여러가지 액상성분을 잘 분석할 수 있다. HPLC의 분리원리나 조작방법 등은 비교적 간단하나 최근에 들어 조작이 편리하고 재현성 및 결과해석을 용이하게 하기 위한 여러가지 부품들을 사용하게 되었다. HPLC는 크게 이동상(Mobile phase), 시료주입부(Injector), 분리관(Column), 검출기(Detector)등으로 구분된다.

II. 표준작동절차

1. 준비사항

1) 사용가스
고순도 He
2) 초순수(Deionized Water)
용리액(Eluent), 표준용액 및 재생액(Regenerant)를 조제하며 반드시 18.0 ㏁이상
의 것을 사용해야 한다.
3) HPLC용 용매(Solvent, HPLC grade)
용리액(Eluent), 표준용액 및 재생액(Regenerant)를 조제하며 반드시 HPLC
grade 이상의 것을 사용해야 한다.

2. 기기의 운영순서

1) Gas valve on

- He ; 이동상의 Degassing
- Air ; Autosampler의 Power

2) Manual Injector등 HPLC 각 부위 및 컴퓨터의 Power ON

3) HPLC를 사용한지 오래됐을 경우 또는 이상압력 발생시 pump에 차있는 air를
빼주기 위해 purge기능을 이용

- purge valve를 open
- 프로그램상에서 유속을 5ml로 올려 purge
- 기포가 제거가 된 상태에서 유속을 0ml로 하여
- purge valve를 close

4) 안정화

- 기기의 상태가 모두 ready 상태가 될 때까지 기다림.

3. 가동

- 사용하고자 하는 이동상이 버퍼일 경우 칼럼을 먼저 3차증류수로
유속 0.3㎖/min 으로 30분이상 washing하여 준다.
- washing 후 사용하고자 하는 이동상으로 유속 0.5㎖/min이하로
서서히 올려주며 최종 사용 유속으로 맞춘다.
- 안정화되었을 때의 펌프 유속에 따른 압력의 변화를 체크하여 이상압력
발생 또는 안정화가 이뤄지지 않았을 경우 아래의 기기이상 체크 참조하여
안정화시킨 후 분석실시
- 검출기 On
- 모든 조건이 안정화 된 후 시료 Injection.

4. 분석조건 예(Analysis condition example) :
시험명 : 화장품중 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)분석

표준물질 50㎎을 MeOH 에 녹여 100㎖가 되도록 한다(500ppm)
↓
필요시마다 상기의 표준물질을 10배 50배 희석하여 working std로 사용
↓
샘플 적당량(표준물질과 비슷한 농도 50～10ppm이 되도록)을 MeOH 로 녹여 100㎖가 되도록 한다
↓
초음파 30분 이상
↓
아래의 분석조건으로 HPLC를 안정화시킨 후 분석

柱 :
HPLC 분석조건
- 컬럼 ; RP-18 동등이상
- 이동상 ; 0.02M (NH4)2HPO4 70 : MeOH 30
(단 인산을 가하여 pH 7.0으로 조정한다)
- 검출기 ; UV 214nm
- 유속 ; 1.4㎖/min

※ 표준용액
Merck 또는 Aldrich社 이상의 Standard 을 사용한다.
〈주〉Standard는 보존방법에 따라 보관한다.
Standard는 사용시마다 제조 또는 시험법에 제시되어 있는 조건에 따라
제조하여 사용 보관한다.

4. Trouble Shooting

4.1 HPLC 사용 시 주의 사항

4.1.1 사용되는 이동상 조건

현재 이동상을 담을 용기는 세척이 잘 된 것입니까?
HPLC에 사용하고자 하는 모든 물은 초 순수(18MΩ)상태입니까?
HPLC에 사용하고자 하는 모든 용매는 HPLC Grade입니까?
HPLC에 사용되는 용매의 UV cutoff는 측정하고자 하는 파장에 비하여 충분히 낮습니까?
두 가지 이상의 용매를 혼합하여 사용하는 경우 서로 잘 혼합 되는지 확인 하였습니까?
용매의 혼합시 각 용매는 따로 계량한 후 혼합하였습니까?
분석하고자 하는 시료가 사용하는 이동상에 잘 녹았습니까?
시료는 상태에 따라 여과 및 전처리가 잘 되어 있습니까?
사용하는 용매는 여과 및 탈기를 마친 상태입니까?
탈기 방법으로 He을 사용하고 있다면 He의 순도가 99.9% 이상입니까?
사용하는 이동상의 pH 범위는 2-8 사이(실리카 컬럼의 pH적용범위)입니까?
* 컬럼의 종류에 따라 다소 차이가 있음.
사용하는 이동상은 당일 제조된 것입니까?

4.1.2 HPLC 작동 시 주의 사항
작동하고자 하는 펌프의 각 채널 (A,B,C,D)에 용매가 채워져 있습니까?
사용하고자 하는 용매가 현재 HPLC에 채워져 있는 용매와 혼합되는 것입니까? (서로 섞이지 않는 용매의 경우, IPA로 세척 후 사용하여야 합니다.)
사용하고자 하는 용매가 Buffer일 경우, 우선 물로 유로를 충분히 세척하였습니까? (물로 세척 시 최소한 컬럼 용량의 10배 정도의 물로 세척)
용매 교체 후 반드시 Purge를 시켜 HPLC 내의 기포를 제거 하였습니까?
현재 시스템에 걸리는 압력이 컬럼 및 검출기의 압력 한계 내에 있습니까?

4.2 일반적인 이상

4.2.1. 압력이 높게 걸린다.

점검 사항
순수한 용매인가?
각종 Filter는 깨끗한가?
Capillary가 막힌 곳은 없는가?
Guard, Main 컬럼 오염

조치 방법
순수한 용매로 교체
Filter 세척 또는 교체
오염된 Capillary 교체
Guard, Main 컬럼 세척

4.2.2 재현성 문제 (정량: 면적, 높이)

점검 사항
순수한 용매인가?
용매 탈기는 잘 되었는가?
유량이 안정한가?
유로 중에 새는 곳이 있는가?
시료 주입 양은 일정한가?
분석 파장이 맞는가?

조치 방법
순수한 용매로 교체
용매 내부에 Air 제거
Air, Valve 상태 점검
새는 부위 확인 후 수리
Syringe, Needle 상태 점검
파장 선택 재확인

4.2.3. Baseline의 불안정(Noise, Drift)

점검 사항
순수한 용매인가?
유로 중에 새는 곳은 없는가?
용매는 잘 섞이는가?
컬럼은 안정한가?
Cell이 오염되지 않았는가?
Lamp 감도는 정상적인가?
UV를 흡수하는 용매인가?

조치 방법
순수한 용매로 교체
새는 부위 확인 후 수리
적절한 용매 사용
용리가 강한 용매로 세척
Cell 세척
감도 확인 후 교체
파장 확인 후 변경

4.3. 부분별 System 점검

4.3.1 펌프(Solvent Delivery System)

점검 사항
유량은 일정한가?
새는 곳이 있는가?
각종 Filter는 깨끗한가?

조치 방법
유량이 일정하도록 점검
새는 부위 확인 후 수
Filter를 세척하거나, 교체

4.3.2 시료 주입기

점검 사항
압력(Air)은 정상인가?
새는 곳이 있는가?
Syringe에 Air는 없는가?
막힌 곳은 없는가?

조치 방법
규정된 압력으로 조정
새는 부위 확인 후 수리
Washing후 사용
막힌 부위 확인 후 수리

4.3.3 컬 럼

점검 사항
Fitting 연결 부위는 잘 맞는가?
온도 설정은 정확한가?
사용 목적에 적합한가?

조치 방법
제조 회사마다 연결 부위 다름 - 확인 후 사용
원하는 온도 확인
컬럼 선택 시 확인

4.3.4 검출기

점검 사항
파장 설정은 정확한가?
Noise, Drift가 생기는가?
램프 감도는 어떠한가?

조치 방법
확인 후 재설정
일반적 증상 찾아 수리
감도 확인 후 교체

5. 내부교정
월 1회 10회 반복측정하며 각 측정 값이 3σ이내에 들어야 한다.



■ 형광편광면역분석기(TDxFLx^®)

소변중의 암페타민류 (메스암페타민, 암페타민)의 예비실험인 형광편광면역분석법(Fluorescence Polarization Immunoassay, FPIA)에 대한 일반적인 실험과정에 대한 내용이다.

1. 목적 및 원리

1) 이론적 기초
: 텅스텐할로겐램프는 임의의 분산각도를 가지는 각기 다른 파장과 색깔의 광선을 방출한다. 이 때 광선원(source)의 전면에 위치한 간섭필터는 청색광선(481-489 nm)만을 통과하게 한다. 이를 통과한 광선은 편광계를 통과하여 평면편광화된 청색광선이 되며 이는 tracer 또는 fluorophore를 여기(excitation)시키게 되는 데, 이는 안정화상태로 돌 아올 때 녹색광선(525-550 nm)을 방출한다.
Trace 또는 fluorophore가 항체와 결합한 상태이면 상대적으로 느리게 회전하며, 이 때 방출된 녹색광선은 청색여기광선과 동일한 평면을 가진다. 반대로 fluorophore가 항체와 결합하지 않은 유리상태이면 회전속도도 빨라 청색여기광선과는 다른 평면을 가지게 되어 편광이 사라지게 된다.
용액속에 존재하는 물질의 회전하는 성질에 따라 편광하는 각도는 다르며 이는 물질의 크기에 비례한다. 즉, 물질의 크기가 크면 편광도가 커진다.

2) 면역분석법과 상경적 결합
: TDx는 trace가 부착된 항원과 원항원(약물)이 항체에 대해 상경적으로 결합하는 원리를 이용한다. 상경적인 결합이 일어나면 항체와 결합한 trace-부착항원이 많을수록 용액속에 남아있는 trace-부착항원의 양은 작다. 만일 용액속에 항원(약물)의 농도가 높다면 상경적 결합반응이 진행된 후에는 용액속에 유리상태의 trace-부착항원이 많이 존재하고 따라서 편광도는 높아지며 약물이 적은 경우에는 편광도가 낮아지게 된다. 이러한 원리를 이용하여 기지의 농도를 가지는 검량물질의 편광도로 검량선을 작성한 후 미지 약물의 편광도로 그 농도를 추정한다.

2. 사용방법

1) 작동시작전의 준비사항

이 과정들은 매일 기계를 작동하기 전에 점검해야 하는 사항이다.
① Waste container - 비어있는지를 확인하고 정확한 위치에 있는지 점검한다.
② Probe 점검 -
③ Dispense 점검 - dispense cover를 열고 “PRIME"을 3회 시행한다.
④ Syringe, tubing 및 연결 부위에 공기방울과 누수가 있는 지와 완충액의 건조된 염이나 오염물질이 있는지를 확인한다.

2) 검량 방법 (Calibration)

2.1. Carousel의 준비
① 검량용 carousel을 선택하여 cartridge와 cuvette을 15개 장착한다.
② 시계방향으로 돌려 carousel을 잠근다.
③ calibrator가 있는 pack을 5번 정도 거꾸로 뒤집어 혼합한다. 피펫으로 calibrator (A - F)를 cartridge에 100μl씩 두 개에 연속적으로 첨가한다. 즉, A를 1과 2에, B를 3과 4에, 연속적으로 F를 11과 12에 첨가한다.
④ 대조물질 (control)이 있는 pack을 5번 정도 거꾸로 뒤집어 혼합한 후 L, M, H의 순으로 13, 14 및 15에 동량 첨가한다.